考点1 基因工程的操作工具
1 基因工程的概念
2 DNA重组技术的基本工具
（1）限制性核酸内切酶（简称：限制酶）：
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
（2）DNA连接酶：
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
②常用类型、来源、功能和结果：
③DNA连接酶和限制酶的关系：
（3）载体：
①种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。
考点2 基因工程的操作过程与应用
1 基因工程的基本操作程序与应用
（1）基因工程的一般操作程序：
（2）基因工程的应用：培育转基因植物和转基因动物，生产基因工程药物，进行基因治疗等。
（3）目的基因导入不同受体细胞的过程：
（4）基因治疗与基因诊断的不同点：
2 蛋白质工程
（1）流程图：
注：A.转录；B.翻译；C.分子设计；D.多肽链；E.预期功能。
（2）技术：基因定点突变、基因融合和基因剪接。
（3）结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
（4）应用：提高胰蛋白酶的活性与稳定性；改变金属硫蛋白对重金属的亲和力；延长白细胞介素-2的作用时间等。
易错点1：与DNA有关的五种酶的比较。
易错点2：几种目的基因获取方法的比较。
易错点3：蛋白质工程与基因工程的比较。
（1）区别：
（2）联系：
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰和改造。
易错点4：PCR补充内容
结果：一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
易错题：
答案：①限制酶②载体③基因表达载体的构建④目的基因的检测和鉴定⑤转基因动物⑥基因治疗⑦基因⑧可产生自然界没有的蛋白质⑨细胞的全能性、细胞膜的流动性⑩植物体细胞杂交11培育作物新品种12细胞增殖13动物细胞核的全能性14获得克隆动物个体15细胞膜流动性16给小鼠注射抗原17产生专一抗体的杂交瘤细胞
1.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（ ）。
A. ①②③④
B. ①②④③
C. ①④②③
D. ①④③②
2.如图是表达新基因所用的质粒的示意图，若将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是（ ）。
A. Hind Ⅲ
B. EcoR Ⅰ
C. EcoB
D. Pst Ⅰ
3.如图甲为某植物的育种流程，图乙表示利用农杆菌转化法获得某种转基因植物的部分操作步骤。下列相关叙述中错误的是（ ）。
A. 图甲子代Ⅰ与原种保持遗传稳定性，子代Ⅱ和子代Ⅲ的选育原理相同
B. 图甲子代Ⅲ选育显性性状需自交多代，子代Ⅴ可能发生基因突变和染色体变异
C. 图乙中①过程的完成需要限制酶和DNA连接酶的参与
D. 图乙中⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多种蛋白质
4.如图是利用基因工程技术生产疫苗的部分过程，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法中正确的是（ ）。
A. 图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物
B. 图示中构建重组载体时，需用到一种限制性核酸内切酶
C. 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
D. 抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
5.人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用高速离心法提纯血液中的乙肝病毒，之后再将其灭活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染风险。如图所示为乙肝基因工程疫苗的生产和使用过程（注：质粒中lacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X－gal，从而使菌落呈蓝色，若无该基因，则菌落呈白色）。请回答下列问题：
（1）过程①最好选用的限制酶方案可以是。
A．Eco R Ⅴ和Bam H ⅠB．Bam H Ⅰ和Eco R Ⅰ
C．Eco R Ⅴ和Eco R ⅠD．只用Bam H Ⅰ
（2）由图中过程③可知，该目的基因的具体功能是
______________________________________________________________。
（3）若要迅速获取大量的目的基因，以提高重组质粒产生的效率，常用的技术是_____________________（写中文全称）。图中过程②常需要用处理，使大肠杆菌细胞转化为感受态细胞。
（4）为了筛选、获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入，培养一段时间挑选出呈_____________________（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养获得大量目的菌。
（5）用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因
________________________________________________________________
6.下列是基因工程的有关问题，请回答：
(1)限制性核酸内切酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是____________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是______________，和限制性核酸内切酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列____________(填“有”或“无”)专一性要求。
(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GA TC—。分析可知，最好选择限制酶________切割质粒，限制酶______切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是_______
______________________、
_____________________________。
7.下图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而Amp r表示氨苄青霉素抗性基因，Tet r表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
（1）过程①所用到的组织细胞是__________，过程④所用的酶是__________。⑤过程常用__________溶液处理大肠杆菌。
（2）经②过程得到的互补DNA片段，称为___________。
（3）如果用限制酶PstⅠ、Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ对图中质粒进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类__________（填“相同”或“不同”），这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有__________种和__________种。
（4）如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后（受体大肠杆菌不含Amp r、Tet r），将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是
_________________________________________________________________。
（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的
_____________________________________________________步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是______________________
8.据报道，美国科研人员通过基因转移技术，从根本上治愈了实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病，这种技术把选定的X基因输入胰腺，这些基因随后得到整合并促使消化系统和其他类型的细胞制造胰岛素，请回答下列问题：
(1)在基因工程中，X基因称为________。利用PCR技术扩增X基因时，需要在反应体系中添加的有机物质是________、________、4种脱氧核糖核苷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程在PCR扩增仪中完成。
(2)将X基因导入小鼠体内之前，需要操作的核心步骤是________________，此步骤最常用的运载工具是________，所需要的酶是限制酶和________。
(3)X基因的检测可从分子水平和个体水平两方面进行，在分子水平上通常采用________技术检测X基因是否导入受体细胞，在个体水平上应检测
__________________________________
答案：
1.C
2.C
3.D
4.D
5.（1）B（2）指导合成乙肝病毒外壳蛋白（3）多聚酶链式反应Ca2＋（4）青霉素和X－gal白色（5）研制血源性疫苗需灭活破坏乙肝病毒的核酸结构，灭活不成功则会导致接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不会引发病毒增殖和感染
6.(1)磷酸二酯键黏性末端和平末端(2)DNA连接酶无(3)ⅠⅡ限制酶Ⅰ切割质粒不会把两个标记基因都破坏目的基因两端均有限制酶Ⅱ的识别序列
7.（1）人垂体组织细胞 DNA连接酶 CaCl2（2）cDNA（3）相同 3 3（4）含四环素抗性基因完整的pBR322质粒（或含有Amp r、Tet r的质粒）在丙中能存活，在乙中不能存活（5）筛选含目的基因的受体细胞 磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基
8.(1)目的基因引物模板DNA(2)基因表达载体的构建质粒DNA连接酶(3)DNA分子杂交实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病是否被根治